Пептидите са клас съединения, образувани от свързването на множество аминокиселини чрез пептидни връзки.Те са повсеместни в живите организми.Досега десетки хиляди пептиди са открити в живи организми.Пептидите играят важна роля в регулирането на функционалните дейности на различни системи, органи, тъкани и клетки и в жизнените дейности и често се използват във функционален анализ, изследване на антитела, разработване на лекарства и други области.С развитието на биотехнологиите и технологията за синтез на пептиди, все повече и повече пептидни лекарства са разработени и прилагани в клиниката.
Има голямо разнообразие от пептидни модификации, които могат просто да бъдат разделени на постмодификация и модификация на процеса (използвайки модификация на получена аминокиселина), и модификация на N-края, модификация на С-края, модификация на страничната верига, модификация на аминокиселина, модификация на скелета, и т.н., в зависимост от мястото на модификация (Фигура 1).Като важно средство за промяна на структурата на основната верига или групите на страничните вериги на пептидните вериги, пептидната модификация може ефективно да промени физичните и химичните свойства на пептидните съединения, да увеличи разтворимостта във вода, да удължи времето на действие in vivo, да промени тяхното биологично разпределение, да елиминира имуногенността , намаляване на токсичните странични ефекти и т.н. В тази статия са въведени няколко основни стратегии за модификация на пептиди и техните характеристики.
1. Циклизиране
Цикличните пептиди имат много приложения в биомедицината и много естествени пептиди с биологична активност са циклични пептиди.Тъй като цикличните пептиди са склонни да бъдат по-твърди от линейните пептиди, те са изключително устойчиви на храносмилателната система, могат да оцелеят в храносмилателния тракт и проявяват по-силен афинитет към целевите рецептори.Циклизирането е най-прекият начин за синтезиране на циклични пептиди, особено за пептиди с голям структурен скелет.Според режима на циклизиране, той може да бъде разделен на тип странична верига - странична верига, терминал - тип странична верига, терминал - тип терминал (тип от край до край).
(1) странична верига към странична верига
Най-често срещаният тип циклизация от странична верига към странична верига е дисулфидното свързване между цистеиновите остатъци.Тази циклизация се въвежда чрез премахване на защитата на двойка цистеинови остатъци и след това окисляване до образуване на дисулфидни връзки.Полицикличният синтез може да бъде постигнат чрез селективно отстраняване на сулфхидрилни защитни групи.Циклизирането може да се извърши или в разтворител след дисоциация, или върху смола преди дисоциация.Циклизирането върху смоли може да бъде по-малко ефективно от циклизирането с разтворител, тъй като пептидите върху смолите не образуват лесно циклифицирани конформации.Друг тип циклизация на страничната верига - страничната верига е образуването на амидна структура между остатък от аспарагинова киселина или глутаминова киселина и основната аминокиселина, което изисква защитната група на страничната верига да може да бъде селективно отстранена от полипептида или върху смолата или след дисоциация.Третият тип циклизация на страничната верига - страничната верига е образуването на дифенилови етери от тирозин или р-хидроксифенилглицин.Този тип циклизиране в природните продукти се среща само в микробни продукти, а продуктите на циклизиране често имат потенциална медицинска стойност.Получаването на тези съединения изисква уникални реакционни условия, така че те не се използват често в синтеза на конвенционални пептиди.
(2) терминал към странична верига
Циклизирането на крайната странична верига обикновено включва С-края с аминогрупата на страничната верига на лизин или орнитин или N-края със страничната верига на аспарагиновата киселина или глутаминовата киселина.Друга полипептидна циклизация се извършва чрез образуване на етерни връзки между терминал С и странични вериги на серин или треонин.
(3) Терминален или тип от глава до опашка
Верижните полипептиди могат да бъдат или циклирани в разтворител, или фиксирани върху смола чрез циклиране на страничната верига.Ниски концентрации на пептиди трябва да се използват при централизация на разтворителя, за да се избегне олигомеризация на пептиди.Добивът на синтетичен пръстенен полипептид от глава до опашка зависи от последователността на верижния полипептид.Следователно, преди да се приготвят циклични пептиди в голям мащаб, първо трябва да се създаде библиотека от възможни верижни водещи пептиди, последвана от циклизация, за да се намери последователността с най-добри резултати.
2. N-метилиране
N-метилирането първоначално се среща в естествените пептиди и се въвежда в пептидния синтез, за да се предотврати образуването на водородни връзки, като по този начин прави пептидите по-устойчиви на биоразграждане и изчистване.Синтезът на пептиди с помощта на N-метилирани аминокиселинни производни е най-важният метод.В допълнение, реакцията на Mitsunobu на N-(2-нитробензен сулфонил хлорид) полипептид-смола междинни продукти с метанол също може да се използва.Този метод е използван за получаване на циклични пептидни библиотеки, съдържащи N-метилирани аминокиселини.
3. Фосфорилиране
Фосфорилирането е една от най-честите посттранслационни модификации в природата.В човешките клетки повече от 30% от протеините са фосфорилирани.Фосфорилирането, особено обратимото фосфорилиране, играе важна роля в контролирането на много клетъчни процеси, като сигнална трансдукция, генна експресия, клетъчен цикъл и регулиране на цитоскелета и апоптоза.
Фосфорилирането може да се наблюдава при различни аминокиселинни остатъци, но най-честите мишени за фосфорилиране са серинови, треонинови и тирозинови остатъци.Производните на фосфотирозин, фосфотреонин и фосфосерин могат или да бъдат въведени в пептидите по време на синтеза, или да се образуват след пептидния синтез.Селективното фосфорилиране може да бъде постигнато с помощта на остатъци от серин, треонин и тирозин, които селективно премахват защитните групи.Някои реагенти за фосфорилиране могат също да въведат групи на фосфорна киселина в полипептида чрез последваща модификация.През последните години беше постигнато специфично за мястото фосфорилиране на лизин с помощта на химически селективна Staudinger-фосфитна реакция (Фигура 3).
4. Миристоилиране и палмитоилиране
Ацилирането на N-терминала с мастни киселини позволява на пептидите или протеините да се свързват с клетъчните мембрани.Миридамоилираната последователност на N-терминала позволява протеин киназите от семейството Src и Gaq протеините на обратната транскриптаза да бъдат насочени към свързване към клетъчните мембрани.Миристиновата киселина се свързва с N-терминала на смолата-полипептид, използвайки стандартни реакции на свързване и полученият липопептид може да бъде дисоцииран при стандартни условия и пречистен чрез RP-HPLC.
5. Гликозилиране
Гликопептиди като ванкомицин и тейколанин са важни антибиотици за лечение на резистентни на лекарства бактериални инфекции, а други гликопептиди често се използват за стимулиране на имунната система.Освен това, тъй като много микробни антигени са гликозилирани, е от голямо значение да се изследват гликопептиди за подобряване на терапевтичния ефект на инфекцията.От друга страна, беше установено, че протеините на клетъчната мембрана на туморните клетки проявяват анормално гликозилиране, което кара гликопептидите да играят важна роля в изследванията на рака и туморната имунна защита.Гликопептидите се получават по Fmoc/t-Bu метод.Гликозилирани остатъци, като треонин и серин, често се въвеждат в полипептиди чрез активирани с пентафлуорофенол естер fMOCs за защита на гликозилирани аминокиселини.
6. Изопрен
Изопентадиенилирането се извършва върху цистеинови остатъци в страничната верига близо до С-терминала.Протеиновият изопрен може да подобри афинитета на клетъчната мембрана и да образува взаимодействие протеин-протеин.Изопентадиенираните протеини включват тирозин фосфатаза, малка GTase, кохаперонови молекули, ядрена ламина и центромерни свързващи протеини.Изопренови полипептиди могат да бъдат получени като се използва изопрен върху смоли или чрез въвеждане на цистеинови производни.
7. Модификация на полиетилен гликол (PEG).
PEG модификацията може да се използва за подобряване на хидролитичната стабилност на протеина, биоразпределението и разтворимостта на пептида.Въвеждането на PEG вериги към пептидите може да подобри техните фармакологични свойства и също така да инхибира хидролизата на пептидите от протеолитични ензими.PEG пептидите преминават през напречното сечение на гломерулните капиляри по-лесно от обикновените пептиди, като значително намаляват бъбречния клирънс.Поради удължения активен полуживот на PEG пептидите in vivo, нормалното ниво на лечение може да се поддържа с по-ниски дози и по-рядко пептидни лекарства.Модификацията на PEG обаче има и отрицателни ефекти.Големите количества PEG пречат на ензима да разгради пептида и също така намаляват свързването на пептида с целевия рецептор.Но ниският афинитет на PEG пептидите обикновено се компенсира от техния по-дълъг фармакокинетичен полуживот и като присъстват в тялото по-дълго, PEG пептидите имат по-голяма вероятност да бъдат абсорбирани в целевите тъкани.Следователно спецификациите на PEG полимера трябва да бъдат оптимизирани за оптимални резултати.От друга страна, PEG пептидите се натрупват в черния дроб поради намален бъбречен клирънс, което води до макромолекулен синдром.Следователно PEG модификациите трябва да бъдат проектирани по-внимателно, когато пептидите се използват за тестване на лекарства.
Често срещаните модификационни групи на PEG модификаторите могат грубо да бъдат обобщени, както следва: Амино (-амин) -NH2, аминометил-Ch2-NH2, хидрокси-OH, карбокси-Cooh, сулфхидрил (-Тиол) -SH, малеимид -MAL, сукцинимид карбонат - SC, сукцинимид ацетат -SCM, сукцинимид пропионат -SPA, n-хидроксисукцинимид -NHS, акрилат-ch2ch2cooh, алдехид -CHO (като пропионал-ald, butyrALD), акрилна основа (-акрилат-acrl), азидо-азид, биотинил - Биотин, флуоресцеин, глутарил -GA, акрилат хидразид, алкин-алкин, р-толуенсулфонат -OTs, сукцинимид сукцинат -SS и т.н. PEG производни с карбоксилни киселини могат да бъдат свързани към n-терминални амини или странични вериги на лизин.Амино-активиран PEG може да бъде свързан със странични вериги на аспарагинова киселина или глутаминова киселина.Неправилно активираният PEG може да бъде конюгиран с меркаптан на напълно депротектирани странични вериги на цистеин [11].PEG модификаторите обикновено се класифицират както следва (забележка: mPEG е метокси-PEG, CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH):
(1) PEG модификатор с права верига
mPEG-SC, mPEG-SCM, mPEG-SPA, mPEG-OTs, mPEG-SH, mPEG-ALD, mPEG-butyrALD, mPEG-SS
(2) бифункционален PEG модификатор
HCOO-PEG-COOH, NH2-PEG-NH2, OH-PEG-COOH, OH-PEG-NH2, HCl·NH2-PEG-COOH, MAL-PEG-NHS
(3) разклоняващ се PEG модификатор
(mPEG)2-NHS, (mPEG)2-ALD, (mPEG)2-NH2, (mPEG)2-MAL
8. Биотинизация
Биотинът може да бъде силно свързан с авидин или стрептавидин и силата на свързване е дори близка до ковалентната връзка.Белязаните с биотин пептиди обикновено се използват в имуноанализа, хистоцитохимия и базирана на флуоресценция поточна цитометрия.Маркирани антибиотични антитела могат също да се използват за свързване на биотинилирани пептиди.Биотиновите етикети често са прикрепени към лизиновата странична верига или N терминала.6-аминокапроновата киселина често се използва като връзка между пептиди и биотин.Връзката е гъвкава при свързване със субстрата и се свързва по-добре при наличие на пространствено препятствие.
9. Флуоресцентно етикетиране
Флуоресцентното маркиране може да се използва за проследяване на полипептиди в живи клетки и за изследване на ензими и механизми на действие.Триптофанът (Trp) е флуоресцентен, така че може да се използва за присъщо маркиране.Емисионният спектър на триптофан зависи от периферната среда и намалява с намаляване на полярността на разтворителя, свойство, което е полезно за откриване на пептидна структура и рецепторно свързване.Флуоресценцията на триптофан може да бъде потушена от протонирана аспарагинова киселина и глутаминова киселина, което може да ограничи употребата му.Дансил хлоридната група (Dansyl) е силно флуоресцентна, когато е свързана с аминогрупа и често се използва като флуоресцентен етикет за аминокиселини или протеини.
Флуоресцентно резонансно преобразуване на енергия (FRET) е полезно за ензимни изследвания.Когато се прилага FRET, субстратният полипептид обикновено съдържа група за маркиране на флуоресценция и група за гасене на флуоресценция.Белязаните флуоресцентни групи се гасят от гасителя чрез нефотонен пренос на енергия.Когато пептидът се дисоциира от въпросния ензим, маркиращата група излъчва флуоресценция.
10. Кейдж полипептиди
Пептидите в клетката имат оптически отстраними защитни групи, които предпазват пептида от свързване с рецептора.Когато е изложен на UV радиация, пептидът се активира, възстановявайки афинитета си към рецептора.Тъй като това оптично активиране може да се контролира според времето, амплитудата или местоположението, кафезните пептиди могат да се използват за изследване на реакции, протичащи в клетките.Най-често използваните защитни групи за кафезни полипептиди са 2-нитробензилови групи и техните производни, които могат да бъдат въведени в пептидния синтез чрез защитни аминокиселинни производни.Производни на аминокиселини, които са разработени, са лизин, цистеин, серин и тирозин.Производните на аспартат и глутамат обаче не се използват често поради тяхната чувствителност към циклизиране по време на пептидния синтез и дисоциация.
11. Полиантигенен пептид (MAP)
Късите пептиди обикновено не са имунизирани и трябва да бъдат свързани с протеини носители, за да произведат антитела.Полиантигенният пептид (MAP) е съставен от множество идентични пептиди, свързани с лизинови ядра, които могат специфично да експресират имуногени с висока ефективност и могат да бъдат използвани за получаване на куплети протеин пептид-носител.MAP полипептидите могат да бъдат синтезирани чрез твърдофазов синтез върху MAP смола.Въпреки това, непълното свързване води до липсващи или съкратени пептидни вериги на някои разклонения и по този начин не проявява свойствата на оригиналния MAP полипептид.Като алтернатива, пептидите могат да се приготвят и пречистват отделно и след това да се свържат с MAP.Пептидната последователност, прикрепена към пептидното ядро, е добре дефинирана и лесно се характеризира чрез масспектрометрия.
Заключение
Пептидната модификация е важно средство за проектиране на пептиди.Химически модифицираните пептиди могат не само да поддържат висока биологична активност, но и ефективно да избегнат недостатъците на имуногенността и токсичността.В същото време химическата модификация може да придаде на пептидите някои нови отлични свойства.През последните години методът за активиране на CH за постмодифициране на полипептиди беше бързо разработен и бяха постигнати много важни резултати.
Време на публикуване: 20 март 2023 г