Фон
Melanotan I, известен също като Afamelanotide, е линеен полипептид, съставен от 13 аминокиселини, който е готов да играе все по-значима роля във фармацевтичните изследвания. Основните английски наименования на Melanotan I са Melanotan-1 и Afamelanotide. Като синтетичен аналог на α-меланоцит-стимулиращия хормон α-MSH), Melanotan I може да се използва за лечение на нарушения на фоточувствителността, причинени от еритропоетична протопорфирия. В момента повечето продукти Melanotan I са етикетирани само за изследователска употреба и все още не са предназначени за приложение при хора. При традиционния твърдофазен синтез изборът на смола значително влияе върху ефективността на свързване и крайната чистота на продукта.
Основна информация
Китайско име: Melanotan 1
Име на английски: Melanotan-1
Фирмен номер: GT-A006
CAS номер: 75921-69-6
Последователност: SYS{Ne}EH{D-Phe}RWGKPV-NH2
Молекулна формула: C78H111N21O19
Молекулно тегло: 1646.88
Начин на приготвяне
аз Получаване на Fmoc-Val-амино смола
Стъпка 1:Претеглете 11,11 g (5 mmol) Ramage Amide AM смола със степен на заместване 0,45 mmol/g и я добавете към твърдофазов реактор. Добавете DCM, за да набъбне смолата в продължение на 30 минути, след това отцедете. Измийте три пъти с DMF. Добавете DMF разтвор, съдържащ 20% пиперидин (v/v) и реагирайте в продължение на 5 минути. Добавете още 20% разтвор на пиперидин DMF и реагирайте в продължение на 10 минути, с едно промиване с DMF между тях. След приключване на реакцията, отцедете и измийте три пъти с DMF.
Стъпка 2:Разтворете 5,09 g Fmoc-Val-OH, 2,02 g HOBT (1-хидроксибензотриазол) и 2,32 ml DIC (N,N'-диизопропилкарбодиимид) в DMF при 0°C. След пълно разтваряне, добавете сместа към реакционната колона и реагирайте при стайна температура в продължение на 1 час. Наблюдавайте хода на реакцията с помощта на нинхидринов тест, като гарантирате отрицателен резултат. След завършване на реакцията, промийте три пъти с DMF, за да получите Fmoc-Val-амино смола.
II. Приготвяне на напълно защитен пептид от смола на Melanotan I.
Стъпка 1:Добавете 20% пиперидин в DMF разтвор (обемно съотношение) към горната Fmoc-Val-аминосмола. Реагирайте за 5 минути, след това добавете друга порция от 20% пиперидин в DMF разтвор и реагирайте за 10 минути. Измийте веднъж с DMF през интервала. След завършване на реакцията се изсушава под вакуум и се промива три пъти с DMF.
Стъпка 2:Разтворете 5,06 g Fmoc-Pro-OH, 2,02 g HOBT (1-хидроксибензотриазол) и 2,32 ml DIC (N,N'-диизопропилкарбодиимид) в DMF при 0°C. След пълно разтваряне, добавете сместа към реакционната колона и реагирайте при стайна температура в продължение на 1 час. Наблюдавайте протичането на реакцията с помощта на нинхидринов тест (тест на Кайзер), докато се получат отрицателни резултати. След завършване, промийте три пъти с DMF, за да получите Fmoc-Pro-Val-аминосмола.
Стъпка 3:Следвайки метода, описан в Стъпка 2, последователно свържете всяка аминокиселина според последователността на Melanotan I. След завършване на реакцията на свързване Ac-Ser(tBu)-OH, измийте три пъти с DMF, три пъти с DCM (дихлорометан) и три пъти с метанол. Изсушава се под вакуум, за да се получат 23,89 g напълно защитен пептид, свързан със смола Melanotan I.
III. Получаване на суров пептид Melanotan I
23.89 g от напълно защитен пептид, свързан със смола Melanotan I, се поставят в облодънна колба. При 0°С, 250 ml от предварително приготвен коктейл за разцепване (съставен от TFA:тиоанизол:фенол:триизопропилсилан:вода = 82.5:7.5:5:3:2 по обем) се добавят бавно при разбъркване. Сместа реагира при ниска температура в продължение на 0.5 часа, последвано от реакция при стайна температура в продължение на 2 часа. Разтворът за разцепване след това се филтрува под вакуум. Този разтвор се добавя бавно към 2 L леденостуден безводен диетилов етер при разбъркване. Суровият пептид се изолира чрез филтруване, промива се три пъти с леденостуден диетилов етер и се получават 8.55 g суров пептид Melanotan I.
IV. Получаване на пречистен пептид Melanotan I
Стъпка 1:Разтворете суровия пептид Melanotan I в 100 ml пречистена вода и филтрирайте през 0,45 μm мембрана, за да получите разтвор на суров пептид.
Стъпка 2:Пречистете суровия меланотан I пептид с помощта на високоефективна течна хроматография (HPLC). Използвайте колона за динамично аксиално компресиране DAC-HB50 с подвижна фаза А (0,05% воден разтвор на трифлуорооцетна киселина) и подвижна фаза В (0,05% трифлуорооцетна киселина в ацетонитрил). Извършете градиентно елуиране за разделяне и пречистване. Открийте пробата с помощта на UV детектор и съберете пептидния разтвор, съответстващ на целевия пик във фракции.
Стъпка 3:След HPLC пречистване се получават 180 ml разтвор на меланотан I трифлуороацетат с чистота над 99%. Разтворът се концентрира до 50 ml чрез ротационно изпаряване.
Стъпка 4:Уравновесете хроматографската колона с дейонизирана вода и заредете 50 ml от пречистения разтвор на Melanotan I трифлуороацетат (чистота >99%). Елуира се в продължение на 50 минути в система с 2% воден разтвор на оцетна киселина. Концентрирайте събрания целеви продукт до 80 ml чрез ротационно изпаряване. Извършете сушене преди замразяване и сушене чрез замразяване, за да получите накрая 5,33 g пречистен пептид Melanotan I, с добив 32,33%.
Време на публикуване: 2026-01-05