Принципът на работа и подготовката на реагента Limulus трипептид/ендотоксинов субстрат

Трипептидът на реагента Limulus е трипептидна субстанция със специфична последователност, извлечена от лизат от кръвни клетки на рак подкова или изкуствено синтезирана. Трипептидът на реагента Limulus е хромогенен субстрат, използван за количествен анализ (като тест за бактериален ендотоксин) за откриване и измерване на компонентите на Грам-отрицателни бактерии—ендотоксини. Когато се въздейства от ензими, активирани от ендотоксини, се освобождава оцветено съединение (като р-нитроанилин), което позволява интензитетът на цвета да бъде измерен и свързан със съдържанието на ендотоксин.

Принцип на работа

Активиране на ендотоксин: В присъствието на ендотоксини, амебоцитите в кръвта на подковонос освобождават ензими, като по този начин задействат коагулационната каскада.

Ензимно действие: Активираният ензим (обикновено съсирващ ензим) след това действа върху хромогенен субстрат.

Хромогенна реакция: Ензимът разцепва субстрата, освобождавайки жълто съединение, наречено р-нитроанилин (pNA).

Количествен анализ: Интензитетът на жълтия цвят е пропорционален на съдържанието на ендотоксин в пробата и обикновено се измерва с помощта на спектрофотометър при абсорбция от 405 nm.

Методи на приготвяне

Трипептидът на реагента Limulus може да бъде получен чрез два подхода по отношение на подготовката.

1. Извличане на естествени компоненти от кръвните клетки на Limulus и получаване на активния трипептид чрез разделяне и пречистване.

2. Използване на технология за синтез на твърда фаза за последователно свързване на специфични аминокиселинни последователности, прецизно контролиране на структурата на трипептида.

Поради политиките за опазване на Limulus (като провинции като Zhejiang, Fujian, Guangdong и Guangxi го изброяват като „провинциална ключова защитена водна дива природа“ / Хонконг издаде разпоредби в края на 2012 г., забраняващи дънното тралене) и тъй като процесът на добив е сложен и предизвикателен, цената на първия метод е относително висока. Ето защо сега често се използва твърдофазов синтез. Чрез последователно свързване на специфични аминокиселинни последователности структурата на трипептида може да бъде прецизно контролирана. Този метод не само гарантира стабилността и консистенцията на продукта, но също така позволява широкомащабно производство, което отговаря на нуждите на фармацевтичната индустрия от тестови реагенти.